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文章来源: BioArt       发布时间:2019-09-03

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2019年8月22日,来自意大利帕多瓦大学的Diego De Stefani和Rosario Rizzuto团队在Nature上发表题为Identification of an ATP-sensitive potassium channelin mitochondria的文章,首次鉴定了存在于人类和小鼠所有组织的线粒体ATP敏感性钾通道蛋白复合物,证实其通过调节线粒体体积和功能响应了胞内能量状态,从而在线粒体生理与疾病过程中起到关键作用。


帕多瓦大学首次鉴定线粒体ATP敏感性钾通道蛋白复合物


为了鉴定线粒体ATP敏感性钾通道复合物,作者分析了一组未知功能的线粒体蛋白,找到了由CCDC51(命名为MITOK)编码的蛋白作为候选。这个基因在脊椎动物中保守编码了一个45kDa的蛋白,具有N末端线粒体定位序列以及一个卷曲螺旋和两个跨膜结构域。人类中该基因有两个亚型,亚型1具有全长但无线粒体定位序列,亚型2是缺少109个氨基酸的剪接变体却含有线粒体定位序列。有数据表明MITOK表达于人类和小鼠的所有组织。


随后作者利用免疫荧光、亚细胞分离等方法证实其定位于线粒体内膜。过表达MITOK后发现,在形态学上,导致了线粒体片段化以及膨胀;在功能上,导致了ΔΨm的下降以及兴奋剂诱导的线粒体Ca2+吸收。总之,过表达MITOK导致了严重的线粒体形态和功能紊乱。Valinomycin(K+离子载体,介导了K+内流入基质)可以非常类似地模拟MITOK过表达的表型;利用重组蛋白和平面脂双层,在仅含有K+一种阳离子的培养液中检测到其通道活性,这个通道显示出ohmic behavior、电压依赖、K+选择性(PK:PCl = 1:0.02);另外,它的通道活性能够被一种K+通道抑制剂barium而非BKCa通道抑制剂paxilline抑制。这些结果明确无误地鉴定了MITOK是一个线粒体K通道蛋白。


然而,MITOK纯化蛋白并不能响应ATP和mitoKATP抑制剂5-HD。进一步研究发现,它的ATP敏感性可以被一个调节性磺酰脲受体样(SUR-like)亚单位ABCB8(因此命名为MITOSUR)赋予。体外共同表达MITOK与MITOSUR后,热稳定试验与膜提取物实验证明它们被共同折叠到脂质体中。4个MITOK与4个MITOSUR亚基能够形成一个八聚体的K+可透过的通道(图一);可被毫摩尔级别浓度的ATP抑制;可被diazoxide激活;可被磺酰脲类格列本脲和5-HD阻断。这些特征包含了mitoKATP应具有的所有功能性电生理特性以及药理学特征。因此,MITOK形成K+透过性通道,而MITOSUR作为调节性亚单位包含ATP结合位点,二者共同形成了能够响应ATP的线粒体K+通道。


帕多瓦大学首次鉴定线粒体ATP敏感性钾通道蛋白复合物

图一 MITOK与MITOSUR组成mitoKATP响应ATP介导K+内流调节线粒体体积


随后,作者对MITOK/MITOSUR复合体的基本生理学功能进行了研究。CRISPR/Cas9敲除MITOK后,导致了以下功能的改变:(1)K+内流对ATP与diazoxide不再敏感,证明MITOK对ATP依赖的K+内流入线粒体是必须的;(2)形态上,敲除MITOK导致了几种油炸圈饼形状的线粒体,这与细胞器K+平衡损伤有关;(3)细胞经历单个线粒体的异步的、快速的以及瞬时去极化;(4)基本和最大氧消耗率的下降。为了深入研究细胞器功能改变的原因,研究人员通过透射电子显微镜研究了线粒体超结构。结果发现,敲除MITOK使得K+内流减少,基质体积发生紧缩,从而导致嵴内腔的加宽。


那么mitoKATP通道是怎样影响线粒体适应能量胁迫的呢?作者使用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖快速下调整体细胞内代谢,导致ATP缺乏,发现线粒体能够发生片段化;代谢胁迫与diazoxide处理下,ROS的产量增加。而这两个过程都必须MITOK的参与。这些数据表明mitoKATP通道调控了线粒体对胞内胁迫的适应,可能是通过调节基质体积。


帕多瓦大学首次鉴定线粒体ATP敏感性钾通道蛋白复合物


最后,作者构建了MITOK敲除小鼠。这些小鼠在出生率、外貌和体重增长率等方面无明显表型(至少直到4个月)。但是敲除小鼠的mitoKATP活性确实受到影响,ATP和diazoxide都不能改变K+内流。最后,做了体外局部缺血-再灌注实验,发现敲除MITOK小鼠几乎完全丧失了diazoxide诱导的药物预处理心脏保护作用,暗示了mitoKATP是diazoxide的靶标分子。


总之,作者鉴定了一个线粒体ATP敏感性钾通道复合物,其由4个通道形成亚单位(MITOK)以及4个含有ATP结合位点的调节性亚单位(MITOSUR)组成。这种mitoKATP可能是协调细胞内能量状态与能量产生的潜在机制,参与了胁迫条件下胞内代谢的稳态控制。


研究背景


线粒体通过氧化磷酸化形成ATP为细胞提供能量,线粒体能量的产生与细胞对能量的需求是相适应的。然而,线粒体产能效率如何适应细胞内ATP水平的具体机制尚不清楚。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)作为细胞内代谢的感受器,能够在能量充足时引起细胞兴奋。线粒体中也存在ATP敏感性钾通道(mitoKATP),受线粒体膜负电位(ΔΨm)驱动吸收K+,并且受到生理水平ATP的抑制。药物二氮嗪(diazoxide)可激活mitoKATP保护心脏免受局部缺血再灌注损伤。因此,mitoKATP很有可能就是连接细胞内能量水平与线粒体产能的关键复合物。然而,mitoKATP分子的鉴定与其药理学特征却不甚清楚。


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